TEKNIK PENGECATAN GRAM DENGAN METYLEN BLUE
 |
| Agensia |
Pemeriksaan ini biasanya dilakukan untuk menunjang diagnososa infeksi G0.
1. Preparat yang telah dibuat, didiamkan beberapa saat di udara, panaskan sebentar dan dinginkan.
2. Preparat posisi horizontal dituangi metylen blue sampai tergenang. Diamkan 1 menit. Cuci dengan air mengalir pada posisi vertikal sampai air tidak berwarna lagi.
3. Preparat posisi horizontal tuangi lugol 1% sampai tergenang. Diamkan 1 menit, cuci di air mengalir.
4. Tuangi air fuchsin lindi 0,35%. Biarkan 30 detik. Cuci.
5. Tegakkan objek glass, keringkan pada udara terbuka.
6. Periksa dibawah mikroskop dengan olie emersi.
1. Preparat yang telah dibuat, didiamkan beberapa saat di udara, panaskan sebentar dan dinginkan.
2. Preparat posisi horizontal dituangi metylen blue sampai tergenang. Diamkan 1 menit. Cuci dengan air mengalir pada posisi vertikal sampai air tidak berwarna lagi.
3. Preparat posisi horizontal tuangi lugol 1% sampai tergenang. Diamkan 1 menit, cuci di air mengalir.
4. Tuangi air fuchsin lindi 0,35%. Biarkan 30 detik. Cuci.
5. Tegakkan objek glass, keringkan pada udara terbuka.
6. Periksa dibawah mikroskop dengan olie emersi.
TEKNIK PENGECATAN GRAM DENGAN METYLEN BLUE
Pemeriksaan ini biasanya dilakukan untuk menunjang diagnososa infeksi G0.
1. Preparat yang telah dibuat, didiamkan beberapa saat di udara, panaskan sebentar dan dinginkan.
2. Preparat posisi horizontal dituangi metylen blue sampai tergenang. Diamkan 1 menit. Cuci dengan air mengalir pada posisi vertikal sampai air tidak berwarna lagi.
3. Preparat posisi horizontal tuangi lugol 1% sampai tergenang. Diamkan 1 menit, cuci di air mengalir.
4. Tuangi air fuchsin lindi 0,35%. Biarkan 30 detik. Cuci.
5. Tegakkan objek glass, keringkan pada udara terbuka.
6. Periksa dibawah mikroskop dengan olie emersi.
Hasil: terlihat coccus berwarna biru tapi dapat dibedakan Diplococcus GO atau Diplococcus Gram (+).
Lihat:
- adanya diplokokus intra/ekstrasel.
- adanya leukosit dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sel epitel dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sekret berupa lendir, pada pemeriksaan tampak sebagai benang merah.
1. Preparat yang telah dibuat, didiamkan beberapa saat di udara, panaskan sebentar dan dinginkan.
2. Preparat posisi horizontal dituangi metylen blue sampai tergenang. Diamkan 1 menit. Cuci dengan air mengalir pada posisi vertikal sampai air tidak berwarna lagi.
3. Preparat posisi horizontal tuangi lugol 1% sampai tergenang. Diamkan 1 menit, cuci di air mengalir.
4. Tuangi air fuchsin lindi 0,35%. Biarkan 30 detik. Cuci.
5. Tegakkan objek glass, keringkan pada udara terbuka.
6. Periksa dibawah mikroskop dengan olie emersi.
Hasil: terlihat coccus berwarna biru tapi dapat dibedakan Diplococcus GO atau Diplococcus Gram (+).
Lihat:
- adanya diplokokus intra/ekstrasel.
- adanya leukosit dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sel epitel dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sekret berupa lendir, pada pemeriksaan tampak sebagai benang merah.
Labels: G0, metylen blue, Pengecatan gram
TEKNIK PEWARNAAN GRAM
Pengecatan gram ini berguna untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.
1. Sediaan diambil menggunakan objek glass. Misalnya pada pasien tersangka GO, sediaan diambil dengan cara duh tubuh yang keluar di muara urethra ditempelkan pada objek glass.
2. Fiksasi. Sediaan apusan pada objek glass difiksasi dengan api bunsen (3-4x), dinginkan.
3. Stain pertama: objek glass posisi horizontal dituangi karbol gentian violet 0,5% atau kristal violet 2%. Biarkan tergenang 0,5 sampai 1 menit. Tuangi garam iodin atau lugol 1% biarkan 0,5 sampai 1 menit. Buang larutan, cuci dengan air mengalir, posisi ditegakkan.
4. Decolorisasi. Tuangi alkohol 96% (aseton) sampai air yang mengalir tidak berwarna lagi. Cuci lagi dengan air mengalir.
5. Stain counter/kontras. Tuangi air fuchsin lindi 0,35% (larutan netral red), larutan safranine 1%. Biarkan 10 detik sampai 1 menit. Buang dan cuci dengan air mengalir. Keringkan dalam posisi tegak.
6. Periksa dengan mikroskop minyak inersi.
Hasilnya:
gram positif: warna violet.
Staphylococcus: kecil bulat tersusun seperti anggur.
Streptococcus: lebih besar dari staphylococcus tersusun seperti rantai.
Candida Sp: pseudohifa, sel tunas, sel ragi, klamidospora.
Gram negatif: merah
sel leukosit PMN, sel epitel.
Neisseria gonorrhoicae: diplococcus, seperti dua ginjal.
Haemophylus ducreyi: streptobasil, bentuk khas seperti rel kereta api.
1. Sediaan diambil menggunakan objek glass. Misalnya pada pasien tersangka GO, sediaan diambil dengan cara duh tubuh yang keluar di muara urethra ditempelkan pada objek glass.
2. Fiksasi. Sediaan apusan pada objek glass difiksasi dengan api bunsen (3-4x), dinginkan.
3. Stain pertama: objek glass posisi horizontal dituangi karbol gentian violet 0,5% atau kristal violet 2%. Biarkan tergenang 0,5 sampai 1 menit. Tuangi garam iodin atau lugol 1% biarkan 0,5 sampai 1 menit. Buang larutan, cuci dengan air mengalir, posisi ditegakkan.
4. Decolorisasi. Tuangi alkohol 96% (aseton) sampai air yang mengalir tidak berwarna lagi. Cuci lagi dengan air mengalir.
5. Stain counter/kontras. Tuangi air fuchsin lindi 0,35% (larutan netral red), larutan safranine 1%. Biarkan 10 detik sampai 1 menit. Buang dan cuci dengan air mengalir. Keringkan dalam posisi tegak.
6. Periksa dengan mikroskop minyak inersi.
Hasilnya:
gram positif: warna violet.
Staphylococcus: kecil bulat tersusun seperti anggur.
Streptococcus: lebih besar dari staphylococcus tersusun seperti rantai.
Candida Sp: pseudohifa, sel tunas, sel ragi, klamidospora.
Gram negatif: merah
sel leukosit PMN, sel epitel.
Neisseria gonorrhoicae: diplococcus, seperti dua ginjal.
Haemophylus ducreyi: streptobasil, bentuk khas seperti rel kereta api.
Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA
April 30, 2008 | By 71mm0 In Mikrobiologi |
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).
Tujuan dari pewarnaan adalah
- untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
- memperjelas ukuran dan bentuk bakteri,
- untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
- menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna,
- serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998).
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983).
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994).
Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991).
Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993).
Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983)
Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005).
TEKNIK DASAR PENGECATAN SEL
Pengecatan Sediaan Biologis
Stain(ing) : membuat warna (biasanya) sesuatu menjadi berbeda dengan sekitarnya (Wilkipedia, the free encyclopedia online), dalam biologi sering diartikan sebagai pengecatan atau pewarnaan.
Pertanyaan sederhana : mengapa pewarnaan/ pengecatan dan apa yang diwarnai?
Sediaan mikroskopis dari jaringan atau sel yang tersering diwarnai, meskipun demikian, sediaan anatomi makroskopik seperti arteri dan vena juga bisa diwarnai menggunakan kombinasi antara cairan latex dan cat tembok warna merah gelap (arteri) atau biru gelap (vena). Tetapi konsep yang terakhir ini berbeda dengan konsep staining dalam biologi.
Mengapa pengecatan/ pewarnaan sel?
Agar pengamatan mikroskopik dari jaringan/ sel menjadi lebih baik.
Merupakan salah satu aspek penting yang perlu diperhatikan dalam laboratorium diagnostik veteriner.
Beragam teknik dan jenis zat warna/ kombinasinya yang digunakan
Banyak prosedur laboratorium diagnostik yang melakukan pemeriksaan sel.
Histopatologi, sitologi, mikrobiologi, dan berbagai pemeriksaan mikroskopik lainnya
Beberapa Zat Pengecat
Mordant : bahan kimia yang digunakan sebagai fiksator/ menjadikan sesuatu (baisanya bahan kimia) tidak terlarut dan dapat beraksi dengan zat warna.
Menurut definisinya : mordant ialah suatu zat warna yang memiliki gugus hidroksil dan karboksil, serta bermuatan negatif dan bersifat anionik. Beberapa mordant juga memiliki gugus amino dan bersifat kationik dan juga membutuhkan keberadaan metal agar bisa menampilkan warna yang lebih baik.
Beberapa metal yang biasanya terikat dengan mordant ialah ion ferri, aluminium,
Sifat anionik dan kationik ini menyebabkannya mampu berinteraksi dengan berbagai molekul yang berada di sel, terutama protein, karena protein memiliki rantai samping asam amino yang bisa bermuatan positif atau negatif, tergantung dari rasio kedua muatan tersebut.
Secara biologis, mordant berperan penting untuk fiksasi protein yang biasanya dalam bentuk koloid menjadi bentuk yang lebih padat dan kemudian bereaksi dengan zat warna.
Beberapa mordant yang sering digunakan ialah hematein (natural black 1), lainnya ialah chromoxane cyanine R (mordant blue 3) dan celestine biru B (mordant blue 14), keduanya biasa digunakan sebagai pengganti dari hematoksilin dengan adanya penambahan garam ferri. Alizarin merah-S (mordant red 3) berguna untuk memperlihatkan keberadaan kalsium pada kerangka embrio atau fetus.
Terkait dengan diagnosa klinis secara mikroskopis, ada beberapa zat pewarna yang umum digunakan, dalam tulisan ini akan ditekankan beberapa zat pewarna yang sering digunakan untuk mewarnai sel dalam disiplin kedokteran hewan/ veteriner.
Hematoksilin : diekstraksi dari sejenis tanaman logwood, jika dioksidasi akan membentuk haematein, senyawa yang berwarna biru keunguan. Digunakan bersama-sama dengan garam Fe(III) atau Al(III) untuk mewarnai inti sel.
Eosin : sering digunakan sebagai zat warna tandingan dari hematoksilin dalam pewarnaan H&E (haematoxylin and eosin) yang populer dalam teknik histologi. Eosin mewarnai sitoplasma sel menjadi merah jambu agak oranye, tergantung pH-nya, eosin juga mewarnai eritrosit menjadi merah sedikit kecoklatan, tergantung pH mediumnya.
Biru metilen : biasa digunakan sebagai pewarna yang umum, hanya untuk membedakan antara sel dan latar belakangnya saja, tanpa bermaksut melakukan kajian differensiasi. Biru metilen memberi warna biru cerah yang bisa bergradasi (biru muda sampai biru agak tua), jika mewarnai sel, bisa memperlihatkan keberadaan morfologi nukleolus dan pola struktur kromatin di dalam nukleolus.
Tujuan Pewarnaan
Tergantung jenis sediaannya dan tujuannya : ini yang pertama harus diperhatikan. Jelasnya, pengecatan bertujuan agar sel lebih mudah diamati dan dievaluasi
Ada beberapa jenis pewarnaan :
Bisa pewarnaan sederhana : hanya untuk melihat bentuk sel, bisa dilakukan dengan menggunakan zat warna biru metilen (tersering) atau zat warna lainnya. Umumnya menggunakan satu jenis zat warna.
Pewarnaan khusus : Agar tampak kontras untuk membedakan beberapa komponen tertentu seperti spora dan kapsel pada sel bakteri atau pewarnaan komponen tertentu di sel seperti karbohidrat, dan lain-lain. Bisa juga pewarnaan komponen patologis tertentu yang mungkin ada di sel seperti badan inklusi. Pewarnaan khusus umumnya memerlukan dua macam zat warna atau lebih, juga memerlukan bahan dan teknik yang biasanya tidak tersedia di laboratorium klinik yang kecil, biasanya dilakukan di laboratorium patologi.
Pewarnaan differensial : bertujuan membedakan sifat tertentu dalam sel, contohnya inti dan sitoplasma digunakan pewarnaan hematoksilin dan eosin.
Inti yang bersifat asam akan menyerap zat warna hematoksilin yang bersifat alkalis (basofilik) dan sitoplasma yang bersifat netral/ sedikit alkalis akan menyerap zat warna yang bersifat asam (eosinofilik).
Pewarnaan differensial lain : dalam teknik mikrobiologi untuk membedakan sifat sel bakteri (pewarnaan Gram dan Ziehl Nielsen).
Pewarnaan differensial : Merupakan pewarnaan penting dalam histopatologi dan sitologi dan merupakan salah satu dasar dalam pengembangan dari pewarnaan polikromatik seperti pewarnaan Romanowsky.
Hasil: terlihat coccus berwarna biru tapi dapat dibedakan Diplococcus GO atau Diplococcus Gram (+).
Lihat:
- adanya diplokokus intra/ekstrasel.
- adanya leukosit dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sel epitel dan jumlahnya LPB/LPK.
- adanya sekret berupa lendir, pada pemeriksaan tampak sebagai benang merah.
Labels: G0, metylen blue, Pengecatan gram
TEKNIK PEWARNAAN GRAM
Pengecatan gram ini berguna untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.
1. Sediaan diambil menggunakan objek glass. Misalnya pada pasien tersangka GO, sediaan diambil dengan cara duh tubuh yang keluar di muara urethra ditempelkan pada objek glass.
2. Fiksasi. Sediaan apusan pada objek glass difiksasi dengan api bunsen (3-4x), dinginkan.
3. Stain pertama: objek glass posisi horizontal dituangi karbol gentian violet 0,5% atau kristal violet 2%. Biarkan tergenang 0,5 sampai 1 menit. Tuangi garam iodin atau lugol 1% biarkan 0,5 sampai 1 menit. Buang larutan, cuci dengan air mengalir, posisi ditegakkan.
4. Decolorisasi. Tuangi alkohol 96% (aseton) sampai air yang mengalir tidak berwarna lagi. Cuci lagi dengan air mengalir.
5. Stain counter/kontras. Tuangi air fuchsin lindi 0,35% (larutan netral red), larutan safranine 1%. Biarkan 10 detik sampai 1 menit. Buang dan cuci dengan air mengalir. Keringkan dalam posisi tegak.
6. Periksa dengan mikroskop minyak inersi.
Hasilnya:
gram positif: warna violet.
Staphylococcus: kecil bulat tersusun seperti anggur.
Streptococcus: lebih besar dari staphylococcus tersusun seperti rantai.
Candida Sp: pseudohifa, sel tunas, sel ragi, klamidospora.
Gram negatif: merah
sel leukosit PMN, sel epitel.
Neisseria gonorrhoicae: diplococcus, seperti dua ginjal.
Haemophylus ducreyi: streptobasil, bentuk khas seperti rel kereta api.
1. Sediaan diambil menggunakan objek glass. Misalnya pada pasien tersangka GO, sediaan diambil dengan cara duh tubuh yang keluar di muara urethra ditempelkan pada objek glass.
2. Fiksasi. Sediaan apusan pada objek glass difiksasi dengan api bunsen (3-4x), dinginkan.
3. Stain pertama: objek glass posisi horizontal dituangi karbol gentian violet 0,5% atau kristal violet 2%. Biarkan tergenang 0,5 sampai 1 menit. Tuangi garam iodin atau lugol 1% biarkan 0,5 sampai 1 menit. Buang larutan, cuci dengan air mengalir, posisi ditegakkan.
4. Decolorisasi. Tuangi alkohol 96% (aseton) sampai air yang mengalir tidak berwarna lagi. Cuci lagi dengan air mengalir.
5. Stain counter/kontras. Tuangi air fuchsin lindi 0,35% (larutan netral red), larutan safranine 1%. Biarkan 10 detik sampai 1 menit. Buang dan cuci dengan air mengalir. Keringkan dalam posisi tegak.
6. Periksa dengan mikroskop minyak inersi.
Hasilnya:
gram positif: warna violet.
Staphylococcus: kecil bulat tersusun seperti anggur.
Streptococcus: lebih besar dari staphylococcus tersusun seperti rantai.
Candida Sp: pseudohifa, sel tunas, sel ragi, klamidospora.
Gram negatif: merah
sel leukosit PMN, sel epitel.
Neisseria gonorrhoicae: diplococcus, seperti dua ginjal.
Haemophylus ducreyi: streptobasil, bentuk khas seperti rel kereta api.
Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA
April 30, 2008 | By 71mm0 In Mikrobiologi |
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).
Tujuan dari pewarnaan adalah
- untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
- memperjelas ukuran dan bentuk bakteri,
- untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
- menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna,
- serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998).
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983).
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994).
Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991).
Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993).
Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983)
Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005).
TEKNIK DASAR PENGECATAN SEL
Pengecatan Sediaan Biologis
Stain(ing) : membuat warna (biasanya) sesuatu menjadi berbeda dengan sekitarnya (Wilkipedia, the free encyclopedia online), dalam biologi sering diartikan sebagai pengecatan atau pewarnaan.
Pertanyaan sederhana : mengapa pewarnaan/ pengecatan dan apa yang diwarnai?
Sediaan mikroskopis dari jaringan atau sel yang tersering diwarnai, meskipun demikian, sediaan anatomi makroskopik seperti arteri dan vena juga bisa diwarnai menggunakan kombinasi antara cairan latex dan cat tembok warna merah gelap (arteri) atau biru gelap (vena). Tetapi konsep yang terakhir ini berbeda dengan konsep staining dalam biologi.
Mengapa pengecatan/ pewarnaan sel?
Agar pengamatan mikroskopik dari jaringan/ sel menjadi lebih baik.
Merupakan salah satu aspek penting yang perlu diperhatikan dalam laboratorium diagnostik veteriner.
Beragam teknik dan jenis zat warna/ kombinasinya yang digunakan
Banyak prosedur laboratorium diagnostik yang melakukan pemeriksaan sel.
Histopatologi, sitologi, mikrobiologi, dan berbagai pemeriksaan mikroskopik lainnya
Beberapa Zat Pengecat
Mordant : bahan kimia yang digunakan sebagai fiksator/ menjadikan sesuatu (baisanya bahan kimia) tidak terlarut dan dapat beraksi dengan zat warna.
Menurut definisinya : mordant ialah suatu zat warna yang memiliki gugus hidroksil dan karboksil, serta bermuatan negatif dan bersifat anionik. Beberapa mordant juga memiliki gugus amino dan bersifat kationik dan juga membutuhkan keberadaan metal agar bisa menampilkan warna yang lebih baik.
Beberapa metal yang biasanya terikat dengan mordant ialah ion ferri, aluminium,
Sifat anionik dan kationik ini menyebabkannya mampu berinteraksi dengan berbagai molekul yang berada di sel, terutama protein, karena protein memiliki rantai samping asam amino yang bisa bermuatan positif atau negatif, tergantung dari rasio kedua muatan tersebut.
Secara biologis, mordant berperan penting untuk fiksasi protein yang biasanya dalam bentuk koloid menjadi bentuk yang lebih padat dan kemudian bereaksi dengan zat warna.
Beberapa mordant yang sering digunakan ialah hematein (natural black 1), lainnya ialah chromoxane cyanine R (mordant blue 3) dan celestine biru B (mordant blue 14), keduanya biasa digunakan sebagai pengganti dari hematoksilin dengan adanya penambahan garam ferri. Alizarin merah-S (mordant red 3) berguna untuk memperlihatkan keberadaan kalsium pada kerangka embrio atau fetus.
Terkait dengan diagnosa klinis secara mikroskopis, ada beberapa zat pewarna yang umum digunakan, dalam tulisan ini akan ditekankan beberapa zat pewarna yang sering digunakan untuk mewarnai sel dalam disiplin kedokteran hewan/ veteriner.
Hematoksilin : diekstraksi dari sejenis tanaman logwood, jika dioksidasi akan membentuk haematein, senyawa yang berwarna biru keunguan. Digunakan bersama-sama dengan garam Fe(III) atau Al(III) untuk mewarnai inti sel.
Eosin : sering digunakan sebagai zat warna tandingan dari hematoksilin dalam pewarnaan H&E (haematoxylin and eosin) yang populer dalam teknik histologi. Eosin mewarnai sitoplasma sel menjadi merah jambu agak oranye, tergantung pH-nya, eosin juga mewarnai eritrosit menjadi merah sedikit kecoklatan, tergantung pH mediumnya.
Biru metilen : biasa digunakan sebagai pewarna yang umum, hanya untuk membedakan antara sel dan latar belakangnya saja, tanpa bermaksut melakukan kajian differensiasi. Biru metilen memberi warna biru cerah yang bisa bergradasi (biru muda sampai biru agak tua), jika mewarnai sel, bisa memperlihatkan keberadaan morfologi nukleolus dan pola struktur kromatin di dalam nukleolus.
Tujuan Pewarnaan
Tergantung jenis sediaannya dan tujuannya : ini yang pertama harus diperhatikan. Jelasnya, pengecatan bertujuan agar sel lebih mudah diamati dan dievaluasi
Ada beberapa jenis pewarnaan :
Bisa pewarnaan sederhana : hanya untuk melihat bentuk sel, bisa dilakukan dengan menggunakan zat warna biru metilen (tersering) atau zat warna lainnya. Umumnya menggunakan satu jenis zat warna.
Pewarnaan khusus : Agar tampak kontras untuk membedakan beberapa komponen tertentu seperti spora dan kapsel pada sel bakteri atau pewarnaan komponen tertentu di sel seperti karbohidrat, dan lain-lain. Bisa juga pewarnaan komponen patologis tertentu yang mungkin ada di sel seperti badan inklusi. Pewarnaan khusus umumnya memerlukan dua macam zat warna atau lebih, juga memerlukan bahan dan teknik yang biasanya tidak tersedia di laboratorium klinik yang kecil, biasanya dilakukan di laboratorium patologi.
Pewarnaan differensial : bertujuan membedakan sifat tertentu dalam sel, contohnya inti dan sitoplasma digunakan pewarnaan hematoksilin dan eosin.
Inti yang bersifat asam akan menyerap zat warna hematoksilin yang bersifat alkalis (basofilik) dan sitoplasma yang bersifat netral/ sedikit alkalis akan menyerap zat warna yang bersifat asam (eosinofilik).
Pewarnaan differensial lain : dalam teknik mikrobiologi untuk membedakan sifat sel bakteri (pewarnaan Gram dan Ziehl Nielsen).
Pewarnaan differensial : Merupakan pewarnaan penting dalam histopatologi dan sitologi dan merupakan salah satu dasar dalam pengembangan dari pewarnaan polikromatik seperti pewarnaan Romanowsky.
